研制高效、無毒的絮凝劑是目前環(huán)境工程領(lǐng)域中的重要內(nèi)容,當(dāng)今絮凝過程的研究趨勢已由過去側(cè)重工藝的優(yōu)化逐漸發(fā)展為現(xiàn)在側(cè)重藥劑的開發(fā).生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細(xì)胞及膠體粒子等凝聚、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物.該類絮凝劑是利用生物技術(shù),通過微生物發(fā)酵、分離提取而得到的具有生物降解性和安全性的新型、高效、廉價、無毒、無二次污染的水處理劑,可廣泛應(yīng)用于給水和廢水處理領(lǐng)域.

生物絮凝劑是典型的環(huán)境友好型功能材料.生物絮凝劑的研究始于20世紀(jì)50年代,日本學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)微生物培養(yǎng)液具有絮凝作用.1976年,Ｊ.Ｎａｋａｍｕｒａ等人對能產(chǎn)生絮凝效果的微生物進(jìn)行了專門研究,掀起了微生物絮凝劑的研究熱潮.目前,該項(xiàng)研究工作集中在:(1)針對單一菌株的分離、鑒定和培養(yǎng)；(2)側(cè)重單一菌株所產(chǎn)絮凝劑的成分確定、凈化機(jī)理及其應(yīng)用研究.生物絮凝劑的研究還僅限于實(shí)驗(yàn)室水平,降低微生物絮凝劑生產(chǎn)成本是大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵.

復(fù)合型生物絮凝劑的概念是哈爾濱工業(yè)大學(xué)馬放教授率先提出的,是以稻草、秸稈等廉價生物質(zhì)材料為底物,利用纖維素降解菌群和絮凝菌群組成的復(fù)合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌菌群,進(jìn)行兩段式發(fā)酵后分離提取而獲得的.本文針對復(fù)合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌高效菌株的篩選和最佳菌群的構(gòu)建進(jìn)行了研究,并對絮凝機(jī)理進(jìn)行了探討.

1　材料與方法

1.1　復(fù)合型生物絮凝劑的制備

1.1.1　菌種來源

絮凝菌來源于某煉油廠含油廢水處理單元曝氣池活性污泥.纖維素降解菌來自本實(shí)驗(yàn)室.

1.1.2　培養(yǎng)基

絮凝菌分離培養(yǎng)基(ｇ/Ｌ):牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[5].篩選培養(yǎng)基:葡萄糖,10.0ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4,5.0ｇ；ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ,0.2ｇ；ＫＨ2ＰＯ4,2.0ｇ；ＮａＣｌ,0.1ｇ；尿素,0.5ｇ；酵母膏,0.5ｇ；ｐＨ,7.2～7.5.種子培養(yǎng)基:同篩選培養(yǎng)基.(注:葡萄糖在0.05ＭＰａ壓力下滅菌30ｍｉｎ,其他成分在0.1ＭＰａ壓力下滅菌20ｍｉｎ).纖維素降解菌種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基為濃縮3倍的赫奇遜培養(yǎng)基[5].

1.1.3　培養(yǎng)條件

1.1.3.1　種子培養(yǎng)

于新鮮斜面上取一環(huán)菌,接至裝有100ｍＬ種子培養(yǎng)基的250ｍＬ三角瓶中,在30℃、150ｒ/ｍｉｎ搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24ｈ.

1.1.3.2　搖瓶培養(yǎng)

在500ｍＬ的三角瓶中裝入250ｍＬ篩選培養(yǎng)基,滅菌后,按10%的接種量將菌種自種子培養(yǎng)基中接入培養(yǎng)基中,在30℃、150ｒ/ｍｉｎ搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)72ｈ,以發(fā)酵液的絮凝效果作為絮凝菌株篩選標(biāo)準(zhǔn).在500ｍＬ的三角瓶中裝入250ｍＬ發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后,接入10%的纖維素降解菌群種子發(fā)酵液.在30℃、150ｒ/ｍｉｎ搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)120ｈ,此時接入10%的絮凝菌種子發(fā)酵液,相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1ｄ.根據(jù)最終發(fā)酵液的絮凝效果確定高效產(chǎn)絮菌株.將復(fù)篩得到的高效絮凝菌進(jìn)行雙菌(1∶1)混合培養(yǎng)的正交試驗(yàn),采用上述相同的方法進(jìn)行培養(yǎng).根據(jù)最終發(fā)酵液的絮凝效果構(gòu)建最佳的絮凝菌群.

1.2　測定方法

1.2.1　絮凝效果測定

初篩:在50ｍＬ量筒內(nèi)加入0.2ｇ高嶺土,1ｍＬ1%的ＣａＣｌ2水溶液,1ｍＬ發(fā)酵液,然后加水至50ｍＬ,搖勻,靜止沉淀15ｍｉｎ,同時以不加菌的培養(yǎng)基的高嶺土懸濁液為對照,目測找出絮凝效果較好的菌株.復(fù)篩:采用混凝杯罐試驗(yàn)來測定絮凝劑的絮凝效果.此法同樣適于絮凝菌群絮凝效果的測定.具體過程為:在燒杯中加入5ｇ/Ｌ高嶺土懸濁液1000ｍＬ,加入10ｍＬ的發(fā)酵液和1 5ｍＬ的10%的ＣａＣｌ2水溶液作為助凝劑,同時以未接絮凝菌的培養(yǎng)基10ｍＬ和1 5ｍＬ的10%的ＣａＣｌ2水溶液作為空白對照.采用六聯(lián)的混凝攪拌儀攪拌完成之后,靜止20ｍｉｎ,然后使用濁度儀測定上清液的濁度,發(fā)酵液的絮凝效果用絮凝率進(jìn)行表征,計(jì)算公式為μ/%=(Ａ-Ｂ)/Ａ×100,其中Ａ表示參照上清液的濁度,Ｂ表示加入發(fā)酵液絮凝之后上清液的濁度.

1.2.2　菌種鑒定

菌株鑒定的生理生化試驗(yàn)參見文獻(xiàn)進(jìn)行.

1 2 3　絮凝活性分布實(shí)驗(yàn)

取10ｍＬ發(fā)酵液,3000ｒ/ｍｉｎ離心15ｍｉｎ,留上清液備用.沉淀物以蒸餾水洗滌2次后,加入10ｍｌ蒸餾水制成懸濁液.分別測定發(fā)酵原液、上清液以及沉淀物懸濁液的絮凝活性.

1.2.4　滅菌失活后絮凝活性測定實(shí)驗(yàn)

將發(fā)酵液在121℃滅菌20ｍｉｎ,測定其絮凝活性.

1.2.5　復(fù)合型微生物絮凝劑有效成分分析

還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸(ＤＮＳ)比色法[8],蛋白質(zhì)含量測定采用Ｆｏｌｉｎ-酚測定法.

2　結(jié)果與討論

2.1　絮凝菌株篩選與鑒定

2.1.1　篩選結(jié)果

從處理含油廢水的活性污泥中共分離出132株菌,初篩得到25株具有絮凝作用的菌株；復(fù)篩采用這25株菌的發(fā)酵液做混凝杯罐試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其中12株為具有明顯絮凝效果的菌株,絮凝率均在65%以上,Ｆ2、Ｆ3、Ｆ5和Ｆ6菌株的絮凝率>80%.

2.1.2　菌種鑒定結(jié)果

對所得12株絮凝菌進(jìn)行生理生化特性鑒定.根據(jù)菌株的菌落形態(tài)和生理生化特性可知,12株菌中,芽孢桿菌屬(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)8株,微球菌屬(Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ)2株,葡萄球菌屬(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ)1株,微桿菌屬(Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)1株,其中4株高效絮凝菌Ｆ2、Ｆ3、Ｆ5和Ｆ6均屬芽孢桿菌屬.

2.2　絮凝菌混合培養(yǎng)

將4株高效絮凝菌株Ｆ2、Ｆ3、Ｆ5和Ｆ6按照(1∶1)接種進(jìn)行混合培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Ｆ2和Ｆ6菌株組合所得發(fā)酵液絮凝效果優(yōu)于其他各組(表1),同時也優(yōu)于各個單菌,這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道相符.ＫｕｒａｎｅＲ和Ｍａｔｓｕｙａｍａ研究結(jié)果表明,混合培養(yǎng)的條件下,不同微生物之間的相互作用促進(jìn)微生物絮凝劑的產(chǎn)生.因此,該研究思路正確可行.后續(xù)試驗(yàn)中均采用Ｆ2和Ｆ6作為復(fù)合型生物絮凝劑產(chǎn)生菌,用于生產(chǎn)復(fù)合型生物絮凝劑ＨＩＴＭ02.

現(xiàn)有研究認(rèn)為,單株微生物的發(fā)酵存在目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率低,培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格和對環(huán)境因素適應(yīng)性差等缺陷,混菌發(fā)酵正逐漸引起人們的重視,有望解決單菌發(fā)酵存在的問題.復(fù)合型生物絮凝劑采用秸稈等富含纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄物作為主要的碳源.國內(nèi)外的研究成果表明,雖然纖維素降解菌及其酶類在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用已研究多年,仍然沒有實(shí)現(xiàn)單一菌種用于大規(guī)模降解纖維素.這是因?yàn)?(1)纖維素酶的合成受到降解物的阻遏,如葡萄糖,纖維二糖、蔗糖和淀粉等皆能抑制此酶的合成；(2)纖維素酶的催化能力受其酶促反應(yīng)的反饋抑制；(3)纖維素酶在酶促反應(yīng)液中不穩(wěn)定,易失活.復(fù)合型生物絮凝劑采用纖維素降解菌群和絮凝菌群兩段式發(fā)酵,發(fā)酵體系中纖維素的降解產(chǎn)物很快被絮凝菌利用,消除了纖維素酶的合成中可能受到的降解物的阻遏作用,使酶可以不斷生成,同時也解除了酶促反應(yīng)終產(chǎn)物對酶的反饋抑制,使酶最大限度地對底物進(jìn)行降解,實(shí)現(xiàn)高糖化率,產(chǎn)生的糖為“共存菌”,即絮凝菌,提供了生長發(fā)育所必需的碳源,實(shí)現(xiàn)了二者的互生和共生,實(shí)現(xiàn)了纖維素降解和微生物產(chǎn)絮兩個過程的有機(jī)組合.

2.3　絮凝活性實(shí)驗(yàn)

2.3.1　絮凝活性分布

發(fā)酵液、離心后上清液以及沉淀物懸濁液的絮凝活性測定結(jié)果表明(圖1),上清液的絮凝活性遠(yuǎn)高于沉淀物,說明絮凝有效成分主要存在于發(fā)酵液中,是微生物細(xì)胞的代謝產(chǎn)物.同時菌體細(xì)胞和纖維素等底物的代謝殘余物質(zhì)有一定的促進(jìn)絮凝的作用.

2.3.2　滅菌失活后絮凝活性測定實(shí)驗(yàn)

將發(fā)酵液在121℃滅菌20ｍｉｎ,測定其絮凝率為94.3%,與未經(jīng)過滅菌處理的發(fā)酵液相比,絮凝率僅下降了2.3%,說明復(fù)合型微生物絮凝劑具有良好的熱穩(wěn)定性.這一結(jié)果也進(jìn)一步說明該絮凝劑中絮凝作用不是由菌體細(xì)胞產(chǎn)生的.相關(guān)文獻(xiàn)表明,高溫會嚴(yán)重影響某些生物絮凝劑的效率.因?yàn)楦邷乜墒股锔叻肿幼冃?空間結(jié)構(gòu)改變,某些活性基團(tuán)不再與懸浮顆粒結(jié)合,因而表現(xiàn)出絮凝活性的下降.例如Ｒ.ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ產(chǎn)生的絮凝劑在100℃的水中加熱15ｍｉｎ后,其絮凝活性下降50%.而復(fù)合型生物絮凝劑在加熱到121℃后,絮凝效果依然保持.這一性質(zhì)將有利于有效成份的提取、純化,為復(fù)合型微生物絮凝劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的安全性提供了保障.

2.4　復(fù)合型微生物絮凝劑有效成分分析及絮凝機(jī)理探討

發(fā)酵液有效成分測定結(jié)果如下:還原糖未檢出,總糖含量為1.76%,蛋白質(zhì)的含量為5.4%.發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的含量最高,并且在絮凝效果不好的批次實(shí)驗(yàn)中,絮凝劑中蛋白質(zhì)的含量明顯降低(1.95%),同時總糖含量變化不大.因此,推斷在絮凝過程中起主要作用的可能是蛋白質(zhì)和多肽,多糖類物質(zhì)對絮凝只起輔助作用.根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分析復(fù)合型微生物絮凝劑的絮凝機(jī)理主要包括以下兩方面:

1)電中和作用:蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),既可與酸又可與堿相互作用.絮凝劑與處理水樣中的顆粒進(jìn)行廣泛的接觸,與顆粒表面帶的相反電荷發(fā)生中和作用,顆粒之間能夠充分地相互靠攏,使得吸引力成為主要作用力,排斥作用減弱,從而形成密實(shí)的絮體,促進(jìn)顆粒的絮凝沉降.

2)吸附架橋作用:發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)、多肽和多糖等物質(zhì)均為半剛性長鏈大分子,投加到水中充分伸展,具有較大空間體積,對水中懸浮粒子具有吸附架橋作用.由掃描電鏡照片(圖2)可以清晰地觀察到,絮凝菌在發(fā)酵過程中分泌大量的黏液性物質(zhì),對水中懸浮顆粒具有一定的吸附作用.

同時,秸稈等富含纖維素的生物底物在發(fā)酵過程中降解不完全,其代謝殘留物可吸附有機(jī)大分子,即本身也具有良好的絮凝作用,作為復(fù)合型生物絮凝劑的一部分,起到良好的“增絮”作用.絮凝體的形成是一個復(fù)雜的過程,復(fù)合型微生物絮凝劑的廣譜活性和耐高溫性說明它是由多種機(jī)理共同起作用.為了更進(jìn)一步解釋絮凝機(jī)理,還需作更深入的研究.通過以上研究可以看出,復(fù)合型微生物絮凝劑的特點(diǎn)是:其一,菌劑是復(fù)合型的,其發(fā)酵是利用纖維素降解菌群和絮凝菌群進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵,而非單一菌種發(fā)酵；其二,有效成分具有復(fù)合性,主要為蛋白質(zhì)、多肽、多糖類物質(zhì)以及底物的代謝殘留物.復(fù)合型微生物絮凝劑的生產(chǎn)通過混菌發(fā)酵,利用了秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物作為發(fā)酵底物,大大降低了生產(chǎn)成本,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ).

3　結(jié)　論

1)從活性污泥中篩選得到4株絮凝率>80%的高效絮凝菌Ｆ2、Ｆ3、Ｆ5和Ｆ6,經(jīng)鑒定均屬芽孢桿菌屬.

2)4株高效絮凝菌中,Ｆ2和Ｆ6菌株按照1:1比例混合培養(yǎng)所得發(fā)酵液絮凝率可達(dá)93 1%,優(yōu)于各個單菌,同時優(yōu)于其他雙菌組合.

3)復(fù)合型生物絮凝劑ＨＩＴＭ02有效成分存在于發(fā)酵液中,具有良好的熱穩(wěn)定性.主要的有效成分包括蛋白質(zhì)、多糖和多肽類物質(zhì),與發(fā)酵過程中纖維素等的代謝殘留物共同作用,具有優(yōu)良的絮凝能力.

4)復(fù)合型生物絮凝劑ＨＩＴＭ02的絮凝機(jī)理包括蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)的電中和作用；蛋白質(zhì)、多肽、多糖等高分子物質(zhì)和纖維素等的代謝殘留物共同具有的吸附架橋作用.
 
 
 

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