微生物強(qiáng)化技術(shù)及其在水處理中的應(yīng)用
來源：北京市水處理環(huán)保材料工程技術(shù)研究中心 閱讀：8051 更新時(shí)間：2014-11-14 13:35
1.微生物檢測技術(shù)
微生物是指一切肉眼看不到或看不清楚的一群微小生物的總稱。個(gè)體微。ㄖ睆叫∮0.1毫米），構(gòu)造簡單。微生物包括細(xì)菌、放線菌、原生動(dòng)物、藻類和原蟲）和非細(xì)胞型微生物（如病毒）等。微生物在自然界分布及其廣泛，在生態(tài)系統(tǒng)中能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)中扮演著重要的角色，微生物不僅是分解者的重要組成部分，并且在生產(chǎn)者中也不乏微生物的存在，其體積小、面積大，吸收多、轉(zhuǎn)化快，生長旺、繁殖快，適應(yīng)強(qiáng)、易變異，分布廣、種類多。
微生物系統(tǒng)以其強(qiáng)大的能量與人類日常生活、健康聯(lián)系非常密切，工業(yè)應(yīng)用也日益廣泛。微生物數(shù)目、種類、群落結(jié)構(gòu)等變化能夠較好的反映其生存環(huán)境的改變，通過這些改變能夠發(fā)現(xiàn)新的過程并解釋過程的機(jī)理，然而微生物小而復(fù)雜，需要一些特殊的技術(shù)檢測，目前微生物監(jiān)測方法主要有傳統(tǒng)微生物學(xué)方法和現(xiàn)代微生物分析方法。
1.1傳統(tǒng)微生物學(xué)方法
傳統(tǒng)微生物分析方法是以培養(yǎng)為基礎(chǔ)，主要集中在對(duì)環(huán)境微生物個(gè)體或菌落水平的觀察和分析，包括微生物的分離、培養(yǎng)、保存，以及微生物呼吸、代謝、分泌物(酶)活性等的測定。然而，自然界中能被培養(yǎng)的環(huán)境微生物非常有限，不到整個(gè)自然界的1%，僅僅依靠以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)微生物分析方法很難滿足當(dāng)今對(duì)微生物資源研究和開發(fā)的需要。
1.2現(xiàn)代微生物分析方法
與傳統(tǒng)微生物分析方法不同，現(xiàn)代微生物分析方法方法不以微生物的培養(yǎng)為前提，而是以分子生物學(xué)、生物標(biāo)記等為基礎(chǔ)，分析不同環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)、生物量以及生物多樣性等的變化。與傳統(tǒng)方法相比，現(xiàn)代微生物分析方法受人為因素影響更小，測得結(jié)果更為準(zhǔn)確，測試指標(biāo)更為全面和詳細(xì)，從中獲取的信息更為豐富。
1.2.1熒光原位雜交(FISH)技術(shù)
熒光原位雜交技術(shù)是根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，檢測該特異微生物種群的存在與豐度。微生物細(xì)胞在載玻片上脫水后，與帶有熒光染料標(biāo)記的寡核糖探針在一定溫度下混合。 具有與探針堿基對(duì)完全互補(bǔ)序列的RNA隨即與探針發(fā)生雜交，從而使該菌體在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。FISH技術(shù)多用于分析單個(gè)細(xì)胞水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)，以rDNA為靶點(diǎn)的寡核苷酸探針，可用于原位鑒定單個(gè)細(xì)胞。
1.2.2變性梯度凝膠電泳(DGGE)
DGGE是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。DGGE對(duì)微生態(tài)的分析一般包括三個(gè)步驟：核酸提取，16SrRNA序列的PCR擴(kuò)增以及DGGE指紋圖譜分析。
DGGE已廣泛用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌, 古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。這一技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢(shì)種類信息并同時(shí)分析多個(gè)樣品，具有可重復(fù)和操作簡單等特點(diǎn), 適合于調(diào)查種群的時(shí)空變化, 并且可通過對(duì)條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落組成。DGGE方法的局限性是，只能分離較小的DNA片段（＜500 bp），使用于系統(tǒng)發(fā)育分析比較和探針設(shè)計(jì)的序列信息量受到了限制。在某些情況下，存在一菌多帶和一帶多菌現(xiàn)象。
1.2.3末端限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)（T-RFLP）
T-RFLP是一種新興的研究微生物多態(tài)性的分子生物學(xué)方法，該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于各種微生物群落的分析比較、研究微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)特征等多方面。
T-RFLP的技術(shù)原理是根據(jù)的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物的5‘末端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，提取待分析樣的中DNA，以他為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)張，所得到的PCR產(chǎn)物的一段就帶有這種熒光標(biāo)記，然后PCR產(chǎn)物有合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。由于在不同細(xì)菌的擴(kuò)增片段內(nèi)存在核苷酸序列的差異，酶切位點(diǎn)就會(huì)存在差異，酶切后就會(huì)產(chǎn)生很多不同長度的限制性片段。消化產(chǎn)物用自動(dòng)測序儀進(jìn)行測定，只有末端帶有熒光性標(biāo)記的片段能被檢測到。因?yàn)椴煌L度的末端限制性片段必然代表不同的細(xì)菌，通過檢測這些末端標(biāo)記的片段就可以反應(yīng)微生物群落組成情況。
1.2.4克隆文庫
克隆文庫法是70年代早期重組DNA技術(shù)的一個(gè)發(fā)展，其原理是針對(duì)目標(biāo)微生物的16S rRNA或功能基因進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接到載體上并與載體一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。帶有重組擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接到載體上并與載體一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。帶有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞經(jīng)過選擇性的培養(yǎng)，最終將帶有正確長度插入片段的克隆篩選出來。再測定克隆產(chǎn)物的基因序列，通過與GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有數(shù)據(jù)的對(duì)比，即可鑒定目標(biāo)微生物的系統(tǒng)發(fā)育地位，許多序列可以鑒定到種的水平。克隆文庫有效地彌補(bǔ)了基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物技術(shù)的局限性，尤其適于對(duì)微生物群落中難以培養(yǎng)或含量不高的微生物種群的分析(Sanz and Kochling 2007)？寺∥膸斓牟蛔闶，煩瑣耗時(shí)，不適合對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。不過，克隆文庫對(duì)某些分子生物學(xué)分析方法有很好的補(bǔ)充作用。
1.2.5高通量測序技術(shù)
高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)，以能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模平行簽名測序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導(dǎo)體測序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 納米球測序 （DNA nanoball sequencing）等。454 Pyrosequencing 是被研發(fā)出的首個(gè)高通量基因組測序系統(tǒng)，它采用的是焦磷酸法測序法。454測序的原理為，纖維化微陣列孔中固定有擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠Bst（Bacillus stearothermophilus,嗜熱脂肪芽孢桿菌）聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白。由于微孔的直徑為29 μm，而一個(gè)磁珠的直徑通常為28 μm，因此每個(gè)孔內(nèi)只能容納一個(gè)磁珠。孔板的一側(cè)為試劑的流動(dòng)室，在測序反應(yīng)時(shí)加入含有固相化ATP硫化酶和熒光素酶的擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠；另一側(cè)為光纖束信號(hào)檢測設(shè)備。測序過程中，每隔數(shù)百個(gè)循環(huán)引入一種未標(biāo)記的核苷酸。在聚合酶的作用下，核苷酸會(huì)結(jié)合在模板序列的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上，同時(shí)釋放出焦磷酸。再在各種酶的催化下，焦磷酸將螢光素氧化成氧化螢光素并釋放出光信號(hào)。使用信號(hào)檢測設(shè)備檢測釋放出的光信號(hào)，即可判斷該種核苷酸在模板上的結(jié)合位點(diǎn)。因此，通過加入不同的核苷酸類別，確定其結(jié)合位點(diǎn)，就可以推知模板的堿基排列順序。相較于其它的第二代測序技術(shù)，454平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)是讀取長度較長。
微生物檢測技術(shù)為微生物在各個(gè)領(lǐng)域的研究工作帶來了諸多便利，較大程度的促進(jìn)了微生物技術(shù)的工程化。尤其在處理各行各業(yè)污水，微生物的更新發(fā)展速度快，如果想要達(dá)到最好的處理效果，對(duì)微生物的生長狀態(tài)、種類、群落結(jié)構(gòu)等的監(jiān)測往往是非常重要的。尤其在微生物強(qiáng)化技術(shù)的應(yīng)用中，由于污水水質(zhì)變化較快并且投加藥劑對(duì)微生物群落都是不小的沖擊，微生物檢測技術(shù)在微生物強(qiáng)化技術(shù)應(yīng)用于污水處理行業(yè)提供了更深一步研究的可能。
2微生物強(qiáng)化技術(shù)的原理及特點(diǎn)
隨著經(jīng)濟(jì)、技術(shù)的不斷發(fā)展，大量的污染物質(zhì)被排放到水體中，其中一些有機(jī)物對(duì)微生物有毒害作用，或者在固有環(huán)境中缺乏降解這些污染物的微生物，再或者一些污染物質(zhì)不能被微生物直接利用，傳統(tǒng)的微生物技術(shù)已經(jīng)不能滿足污水處理的需要。這就需要用到微生物強(qiáng)化技術(shù)。生物強(qiáng)化技術(shù)是向傳統(tǒng)的生物處理系統(tǒng)中引入具有特定功能的微生物,提高有效微生物的濃度,增強(qiáng)對(duì)難降解污染物的降解能力,提高其降解速率,并改善原有生物處理體系對(duì)目標(biāo)污染物的去除效能。將利用生物強(qiáng)化技術(shù)得到的菌種應(yīng)用到傳統(tǒng)生物技術(shù)中去或者開發(fā)適合微生物強(qiáng)化技術(shù)的新的處理工藝，受到了越來越多的關(guān)注。
2.1生物強(qiáng)化技術(shù)原理
生物強(qiáng)化技術(shù)通過微生物的直接作用，共代謝作用，基因水平轉(zhuǎn)移作用，等幾種方式來降解污染物。
2.1.1 直接作用
直接作用就是通過馴化、篩選、誘變、基因重組等技術(shù)得到一株以目標(biāo)降解物質(zhì)為主要碳源和能源的微生物，并向處理系統(tǒng)中投入一定量的該菌種，以增強(qiáng)去除效果。
2.1.1.1對(duì)有機(jī)物的直接作用
就有機(jī)物而言，隨著工業(yè)的發(fā)展和人們生活水平的提高，大量的有機(jī)物排放到水體中，使水體發(fā)黑發(fā)臭，富營養(yǎng)化，嚴(yán)重影響了水體的功能和質(zhì)量。復(fù)雜有機(jī)物在微生物胞外酶的作用下轉(zhuǎn)變成簡單那有機(jī)物，簡單有機(jī)物被好氧微生物吸收后，在好氧微生物胞內(nèi)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2和H2O，被厭氧微生物吸收后在胞內(nèi)酶的作用下轉(zhuǎn)變成CO2、H2O、H2、CH4、H2S及有機(jī)酸、醇、酮、醛等未完全氧化的氧化產(chǎn)物。其中有一些復(fù)雜有機(jī)物難以被微生物利用，或者會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用，從而會(huì)對(duì)為微生物的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。由于有機(jī)污染物兼具污染物和碳源的特性，會(huì)對(duì)水體中微生物群落產(chǎn)生十分復(fù)雜的影響，它對(duì)環(huán)境中微生物的影響是具有選擇性的，一些種群因受到毒害而沒落，但是能夠分解這種有機(jī)物的微生物種群能夠得以幸存和發(fā)展，因而我們可以利用某些微生物的這種特性去降解一些復(fù)雜，難降解，有毒害的有機(jī)污染物。
2.1.2.2對(duì)重金屬的直接作用
某些微生物在重金屬元素的脅迫下，通過調(diào)整自身新陳代謝活動(dòng)，適應(yīng)了受重金屬污染的環(huán)境，通過各種機(jī)制對(duì)重金屬產(chǎn)生了抗性，并且可以對(duì)重金屬進(jìn)行吸附、絡(luò)合、沉淀和化合價(jià)轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到去毒作用。對(duì)重金屬有抗性的微生物種群是修復(fù)重金屬污染微生物的主要來源。
微生物主要通過四種方式實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬污染的修復(fù)：一、微生物可以吸附環(huán)境中的重金屬，研究表明，細(xì)菌、真菌等微生物具有吸附重金屬離子的功能，吸附過程包括兩個(gè)階段，胞外吸附和胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。首先，由于微生物的細(xì)胞壁表面含有一些基團(tuán) （例如巰基、磷酰基、羥基、羧基），這些基團(tuán)都含有 P、S、O 等原子，這些原子都含有孤對(duì)電子能為重金屬離子提供配位絡(luò)合的電子對(duì)，使重金屬結(jié)合在細(xì)胞壁上，然后被吸附的金屬離子通過主動(dòng)運(yùn)輸被轉(zhuǎn)移到微生物細(xì)胞內(nèi)，供其生命活動(dòng)，或被積累下來。二、利用微生物的氧化還原作用能夠改變重金屬離子的價(jià)態(tài)，可以將重金屬轉(zhuǎn)變成不易溶解的沉淀狀態(tài)使其毒性降低，從而達(dá)到去毒作用；三，微生物對(duì)重金屬的絡(luò)合、沉淀作用。一方面微生物可以通過直接作用，或向環(huán)境中釋放代謝產(chǎn)物改變重金屬所處環(huán)境的PH值，使其沉淀下來降低毒性；另一方面，微生物的某些代謝產(chǎn)物排出體外后可以與環(huán)境中的重金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，改變其遷移性和毒性。
2.1.2共代謝
共代謝是指對(duì)于一些有毒有害物質(zhì)，微生物不能以其為碳源和能源生長，但在其它基質(zhì)存在的情況下，微生物能夠改變這種有害物的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其降解。大部分有機(jī)化合物難以被微生物直接作為生長碳源和能源使用而被降解，共代謝是此類化合物主要微生物降解機(jī)制。例如牦牛分枝桿菌在丙烷上生長的同時(shí)，有能力共代謝環(huán)己烷，將環(huán)己烷氧化成能被假單胞菌種群利用的環(huán)己酮，而這些假單胞菌沒有能力直接利用環(huán)己烷。共代謝機(jī)制的存在可能是由于一、微生物體內(nèi)缺少進(jìn)一步降解的酶系，二、中間產(chǎn)物的抑制作用，三、需要另外的基質(zhì)，或必須和其它微生物聯(lián)合作用。共代謝機(jī)制的存在，大大拓展了微生物對(duì)難降解有機(jī)物的作用范圍。但是共代謝微生物生長緩慢，物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率低，容易引起一些有毒物質(zhì)的積累。目前關(guān)于有機(jī)物共代謝的機(jī)制還沒有完全研究清楚，但共代謝作為一種代謝機(jī)制廣泛存在于共基質(zhì)的生物降解過程中，并作為一種新技術(shù)在難降解有機(jī)廢水治理中已取得了應(yīng)用。
2.1.3基因水平轉(zhuǎn)移作用
細(xì)菌中的一些核心基因被認(rèn)為是比較保守的,是垂直遺傳的,而水平基因轉(zhuǎn)移是指在差異生物個(gè)體之間所進(jìn)行的水平遺傳物質(zhì)的交流。水平基因轉(zhuǎn)移的最早證據(jù)是發(fā)現(xiàn)抗生素的廣泛使用后的抗性基因的快速擴(kuò)散。研究表明細(xì)菌間水平基因轉(zhuǎn)移包括接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)3種基本方式。水平基因不具有種間或基因組間的特異性,能在細(xì)菌間廣泛轉(zhuǎn)移。接種含有可移動(dòng)基因組分可為微生物引入特定特征的代謝基因。一旦代謝活性的基因組分在土著微生物中轉(zhuǎn)移、表達(dá),就不再需要供體。例如，Springael等向活性污泥和活性污泥-膜生物反應(yīng)器中引入P.putidaBN210菌株,這種微生物攜帶能降解3-氯苯甲酸(3CBA)的clc基因。利用PCR-DGGE分析表明,盡管2個(gè)反應(yīng)器中BN210菌株消失,反應(yīng)器仍具有降解3CBA性能,表明clc基因組分已轉(zhuǎn)移到土著微生物中。降解基因的水平轉(zhuǎn)移使細(xì)菌群落能更快的適應(yīng)污染環(huán)境，有力的促進(jìn)了環(huán)境中一些污染物的降解，從而增強(qiáng)了微生物生物修復(fù)效果。
2.2 微生物強(qiáng)化技術(shù)的實(shí)現(xiàn)
我們可以通過從自然界中篩選菌株，構(gòu)建基因工程菌，購買商業(yè)菌劑來實(shí)現(xiàn)來獲得高效的菌株。
2.2.1高效菌株的培育
2.2.1.1從自然界中篩選菌株
在自然界中，處理污染所需要的菌株與其它微生物混雜在一起，為了獲取高效菌株，就必須將其從混雜的微生物群體中分離出來，進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵培養(yǎng)。要獲得高效菌株，在長期馴化或受污染環(huán)境中,通過選擇性培養(yǎng)基分離具有特定降解性能的微生物,再通過富集培養(yǎng)、多次分離純化得到高效微生物用于生物強(qiáng)化,具直到現(xiàn)在,利用這種分離方法篩選到的高效菌仍是生物強(qiáng)化技術(shù)的主流。理想菌株的篩選是生物強(qiáng)化技術(shù)決定性因素;新的生態(tài)環(huán)境對(duì)生物強(qiáng)化效果也有重要影響。
2.2.1.2構(gòu)建基因工程菌
構(gòu)建基因工程菌，也就是運(yùn)用微生物遺傳學(xué)的手段去改造微生物特性,使之獲得高耐毒性、高降解活性以及特異或廣譜降解污染物等優(yōu)良遺傳性狀,從而創(chuàng)造出新的高效生物處理工藝。利用高效降解基因工程菌生物強(qiáng)化處理難降解污染物，有利于提高污染物降解速率，并對(duì)提高處理系統(tǒng)的抗沖擊負(fù)荷能力具有顯著效果.
基因工程菌的構(gòu)建過程主要包括以下的 5個(gè)方面:1、從供體細(xì)胞中分離出基因組 DNA, 用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA和載體分子切開;2、用 DNA 連接酶將含有外源基因的DNA 片段接到載體分子上, 形成 DNA 重組分子;3、 借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將 DNA 重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中;4、短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞, 以擴(kuò)增 DNA 重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中;5、篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞, 獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞。
作為現(xiàn)代生物工程的關(guān)鍵技術(shù), 基因工程的主體戰(zhàn)略思想是外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá),近年來研究人員對(duì)基因工程菌進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的成就。例如，白腐真菌產(chǎn)生的木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)在污染治理領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景,但其發(fā)酵生產(chǎn)受到白腐真菌自身生長調(diào)控條件的限制,LiP基因的異源表達(dá)是解決這個(gè)瓶頸問題的有效途徑。本課題組通過實(shí)驗(yàn)，獲得了白腐真菌木質(zhì)素過氧化物酶(LiPH2)基因,分別將其轉(zhuǎn)化于巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和大腸桿菌(Escherichia coli),獲得LiPH2基因的異源表達(dá)特性。并用于廢水脫色處理，獲得了良好的效果。
2.1.1.3 購買商業(yè)菌劑
微生物制劑是指將從自然界中篩選出或人工培育、具有特定降解功能的微生物，來制成菌液制劑，或?qū)⑵涓街谳d體上制成干粉制劑，以改善環(huán)境狀況和強(qiáng)化處理系統(tǒng)為目標(biāo)，通過菌群構(gòu)建等科學(xué)方法得到的具有特殊功能的生物制品。商業(yè)菌劑中通常含有處理污染所需要的完整的微生物群落，由自養(yǎng)、異養(yǎng)、兼性菌構(gòu)成。
選擇購買商業(yè)菌劑時(shí)注意一下事項(xiàng)：1、在較低或較高溫度下生長的能力;2、抵抗高濃度污染物的能力；3、抗重金屬的能力；4、在較寬泛的環(huán)境和介質(zhì)中生存的能；5、產(chǎn)生生物表面活性劑，更利于與污染物接觸。
本課題組已經(jīng)分離、鑒定了多株可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體修復(fù)的光合細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌、氨氧化菌群與反硝化細(xì)菌，并形成復(fù)合菌劑，在污染水體中實(shí)現(xiàn)了初步應(yīng)用。微生物掛膜菌劑，該產(chǎn)品是卓越的活性微生物和酶的混合體，含有異養(yǎng)硝化細(xì)菌，好氧反硝化細(xì)菌，芽孢桿菌和光合細(xì)菌等多種微生物以及脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶等生物酶。
2.2.2 高效菌種在投加系統(tǒng)內(nèi)的保持及活力表達(dá)
陌生的生態(tài)環(huán)境也是生物強(qiáng)化技術(shù)成功的一個(gè)主要障礙。有時(shí)生物強(qiáng)化技術(shù)的失敗并不是由于缺乏相關(guān)的、具有代謝功能的微生物,而是由于缺乏維持微生物正常代謝功能和活性的環(huán)境條件。盡管各種單一的或混合菌株加入生態(tài)系統(tǒng)中能夠提高該生態(tài)系統(tǒng)中生物降解潛能,但效果經(jīng)常是短暫的。原生、后生動(dòng)物的捕食,與土著微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)、電子受體,濕度、溫度、pH、DO、污染物濃度、毒性和微量元素等多種因素共同影響生物強(qiáng)化的效果。因此,為了給外源微生物創(chuàng)造良好的生態(tài)環(huán)境,一方面,可通過生物刺激與生物強(qiáng)化相結(jié)合,提高外源微生物的競爭力,如提供充足的營養(yǎng)、微量元素等,另一方面,通過各種固定化手段防止接種微生物流失,減少直接捕食等。
2.3 生物強(qiáng)化技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)
盡管生物強(qiáng)化在生物修復(fù)中的作用在環(huán)境微生物學(xué)術(shù)界的評(píng)價(jià)褒貶不一,而且許多成功的實(shí)踐都僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段,但存在對(duì)微生物有毒性作用的污染物或缺乏一定數(shù)量和質(zhì)量有效微生物的生物處理系統(tǒng)中,生物強(qiáng)化技術(shù)有明顯的優(yōu)勢(shì)。微生物強(qiáng)化技術(shù)操作簡單，能夠因地制宜，靈活的應(yīng)用于不同污染特性的環(huán)境中，這種技術(shù)針對(duì)性強(qiáng)，能夠有效針對(duì)目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生作用，并且見效速度快。但是同時(shí)微生物強(qiáng)化技術(shù)也存在著自身的不足和問題，系統(tǒng)中的高效菌的不易存活，并且容易流失，其數(shù)量和活性不容易控制，其次，對(duì)于投加基因工程菌進(jìn)行生物強(qiáng)化還存在一定的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。
3 微生物強(qiáng)化在水處理中的應(yīng)用
生物強(qiáng)化技術(shù)具有高效去除目標(biāo)污染物、加速系統(tǒng)啟動(dòng)、提高系統(tǒng)抗水力及有機(jī)負(fù)荷能力以及優(yōu)化系統(tǒng)菌。群結(jié)構(gòu)和增強(qiáng)功能穩(wěn)定性等功能，在廢水生物處理實(shí)際應(yīng)用中潛力巨大。國內(nèi)外生物強(qiáng)化處理技術(shù)在水處理方面的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)：（1）高濃度有機(jī)廢水；（2）有毒、有害難降解污染物的治理；（3）脫氮除磷；（4）改善系統(tǒng)污泥特性，降低污泥產(chǎn)量；（5）強(qiáng)化廢水中油脂的液化和降解；（6）江河湖泊等的水體修復(fù)；（7）地下水生物修復(fù)；
3.1去除難降解有機(jī)物
研究者們利用各種手段分離到具有特定降解性能的微生物，通過生物強(qiáng)化手段，提高有效微生物的濃度，改善生物系統(tǒng)的處理效果。
Wang等以喹啉作為目標(biāo)污染物，在厭氧-缺氧-好氧(A/A/O)系統(tǒng)以喹啉降解菌Burkholderia pickettii強(qiáng)化處理焦化廢水。結(jié)果表明，厭氧、缺氧和好氧反應(yīng)器中COD的去除率分別為25%、16%和59%。Shi等在活性污泥反應(yīng)器后設(shè)置以2,4-DCP降解菌為生物強(qiáng)化菌劑處理生活污水和多氯酚的混和液的反應(yīng)器，結(jié)果表明，2, 4-DCP降解菌不僅提高了2, 4-DCP的處理效率，同時(shí)提高其他多氯酚如4-氯酚、2, 4, 5-三氯酚的去除率，并改善了系統(tǒng)抗毒性物質(zhì)沖擊負(fù)荷能力。
在含有難降解化合物的造紙廢水、制藥廢水、染料廢水和農(nóng)藥廢水生物處理中，應(yīng)用高效微生物強(qiáng)化，都取得了一定的成效。隨著進(jìn)入水體環(huán)境污染物種類增多, 很多是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物或多種化合物的混合物, 只有非常專一的菌株或具有特定代謝性能的微生物才能降解。如一些典型的化學(xué)污染物包括多環(huán)芳烴、鹵化有機(jī)物、多氯聯(lián)苯、多硝基芳烴和有機(jī)磷等農(nóng)藥和殺蟲劑。由于這些物質(zhì)對(duì)微生物有毒害作用, 相應(yīng)具有代謝功能的微生物數(shù)量很少, 因此這些物質(zhì)會(huì)長期殘留在環(huán)境中, 造成污染。用常規(guī)的生物處理方法很難達(dá)到理想的效果, 生物強(qiáng)化技術(shù)成為有效的輔助手段。
3.2去除廢水中過量營養(yǎng)物
由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)排放大量的無機(jī)鹽，使水體中氮、磷等營養(yǎng)物含量過高，引起富營養(yǎng)化。而生物法處理這些污染物時(shí)，相應(yīng)的微生物生長緩慢，或維持高濃度微生物的條件控制困難。如生物硝化工藝主要缺點(diǎn)之一是啟動(dòng)時(shí)間長、污泥流失或遭受沖擊負(fù)荷后很難恢復(fù)。這些問題主要是由于硝化菌生長速率緩慢，硝化菌產(chǎn)率低，因此生物強(qiáng)化技術(shù)被廣泛引入相應(yīng)的生物處理系統(tǒng)中。Satoh等研究了硝化菌生物強(qiáng)化對(duì)轉(zhuǎn)盤生物膜反應(yīng)器啟動(dòng)的影響, 表明硝化菌強(qiáng)化極大地促進(jìn)生物膜中硝化菌群的高密度生長, 導(dǎo)致快速啟動(dòng)和原位硝化活性的提高。接種的微生物能在生物膜中擴(kuò)增或繁殖。硝化菌的加入提高了生物膜表面硝化菌的豐度, 從而導(dǎo)致硝化速率加快。
許燕濱等采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，將兩株具有含氯有機(jī)化合物降解特性的菌假單胞T21和諾卡氏菌RB21融合構(gòu)建成一株高效降解含氯有機(jī)化合物工程菌，應(yīng)用于造紙漂白廢水后顯示融合菌去除CODCr和總氯的能力比混合菌分別提高72.05%和190%。Belia等利用純培養(yǎng)菌株Acinetobacter lwoffii對(duì)傳統(tǒng)活性污泥進(jìn)行強(qiáng)化, 使聚磷菌在微生物中占主導(dǎo)地位, 成為強(qiáng)化生物除磷工藝(EBPR)。實(shí)驗(yàn)證實(shí), 生物強(qiáng)化14d后能夠?qū)鹘y(tǒng)污水處理廠的活性污泥轉(zhuǎn)化成為EBPR污泥, 能適應(yīng)磷負(fù)荷沖擊。
3.3維持生物系統(tǒng)的穩(wěn)定性
污染物的化學(xué)性質(zhì)、濃度、環(huán)境的理化特征(pH、氧化還原電位和溫度等)、微生物對(duì)污染物的可利用性等多種因素影響微生物的生存及代謝活性。生物處理系統(tǒng)易受各種因素的影響導(dǎo)致系統(tǒng)不穩(wěn)定, 甚至系統(tǒng)崩潰。利用生物強(qiáng)化技術(shù), 可提高有效微生物濃度, 減輕各種外界因素對(duì)系統(tǒng)的沖擊。
Boon等研究了3-氯苯胺對(duì)活性污泥反應(yīng)器的沖擊、對(duì)系統(tǒng)受沖擊后氨氮去除效率的恢復(fù)、污泥菌群結(jié)構(gòu)和功能的變化，如硝化效果、有機(jī)物去除效率和污泥沉降性能等多方面的影響。在非生物強(qiáng)化的反應(yīng)器中，受3-氯苯胺2d的沖擊后，出現(xiàn)氨氮積累，硝化活性在12d內(nèi)不能恢復(fù)，COD的去除率下降36%；而生物強(qiáng)化反應(yīng)器中硝化活性在4d內(nèi)恢復(fù)，COD的去除效率沒有下降。結(jié)果表明，接種32氯苯胺降解菌株強(qiáng)化加速了32氯苯胺的降解，保護(hù)硝化菌群，改善反應(yīng)器受毒害物質(zhì)沖擊后的恢復(fù)能力。
4本中心在微生物強(qiáng)化方面的成果
北京市水處理環(huán)保材料工程技術(shù)研究中心，通過多年的科研工作，在基因工程菌，微生物菌劑及濕地生物強(qiáng)化方面取得了顯著成績，并在河湖污染水體的生態(tài)修復(fù)、生活及工業(yè)廢水處理中得到了應(yīng)用，取得了良好的效果。
4.1基因工程菌-白腐真菌
白腐真菌產(chǎn)生的木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)在污染治理領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景,但其發(fā)酵生產(chǎn)受到白腐真菌自身生長調(diào)控條件的限制,LiP基因的異源表達(dá)是解決這個(gè)瓶頸問題的有效途徑。
本課題組通過實(shí)驗(yàn)，獲得了白腐真菌木質(zhì)素過氧化物酶(LiPH2)基因,分別將其轉(zhuǎn)化于巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和大腸桿菌(Escherichia coli),獲得LiPH2基因的異源表達(dá)特性。并用于廢水脫色處理，獲得了良好的效果。
Burkholderia cepacia G4，在芳香族化合物存在的條件下能夠共代謝三氯乙烯(TCE)，但降解中間產(chǎn)物會(huì)對(duì)該菌起毒害抑制作用。通過Tn5插入產(chǎn)生Burkholderia cepacia G4 5223-PR1，能夠從結(jié)構(gòu)上表達(dá)降解TCE的鄰甲苯單氧合酶，因此在沒有誘導(dǎo)物（如芳香族化合物）的情況下也可降解TCE。
4.2微生物復(fù)合菌劑
本課題組已經(jīng)分離、鑒定了多株可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體修復(fù)的光合細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌、氨氧化菌群與反硝化細(xì)菌，并形成復(fù)合菌劑，在污染水體中實(shí)現(xiàn)了初步應(yīng)用。微生物掛膜菌劑，該產(chǎn)品是卓越的活性微生物和酶的混合體，含有異養(yǎng)硝化細(xì)菌，好氧反硝化細(xì)菌，芽孢桿菌和光合細(xì)菌等多種微生物以及脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶等生物酶。
4.3生物強(qiáng)化濕地
叢枝菌根真菌廣泛存在于陸生環(huán)境中，對(duì)促進(jìn)逆境下植物生長，植物抗污染脅迫，抗病蟲害，加速環(huán)境污染修復(fù)進(jìn)程等都有積極作用。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)濕地植物生長，抗重金屬鉛鎘脅迫等有積極作用。目前正在調(diào)查濕地叢枝菌根真菌和菌根化植物的多樣性，為強(qiáng)化濕地植物的生長和抗逆能力提供基礎(chǔ) 。
采用分子生物學(xué)手段，檢測微生物群落變化規(guī)律與處理效果的關(guān)系，提出基于群落結(jié)構(gòu)調(diào)控的強(qiáng)化手段。
5結(jié)語
由于廢水處理系統(tǒng)是一個(gè)半開放有些甚至完全開放的復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，水質(zhì)水量、環(huán)境條件的波動(dòng)，強(qiáng)化菌與各種土著微生物相互作用以及操作條件的變化等都會(huì)給強(qiáng)化系統(tǒng)的處理效果帶來不可預(yù)測的影響,許多成功的實(shí)踐都僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段, 但存在對(duì)微生物有毒性作用的污染物或缺乏一定數(shù)量和質(zhì)量有效微生物的生物處理系統(tǒng)中, 生物強(qiáng)化技術(shù)有明顯的優(yōu)勢(shì)。對(duì)現(xiàn)場生態(tài)特征有全面理解的基礎(chǔ)上, 原位生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)已成為去除污染物的環(huán)境友好技術(shù)之一。用特定的有效微生物強(qiáng)化, 可提高廢水生物處理系統(tǒng)中難降解有機(jī)物的降解效率、改善系統(tǒng)脫氮除磷效率、提高系統(tǒng)穩(wěn)定性等。
高效微生物篩選是生物強(qiáng)化技術(shù)成功的決定性因素。改進(jìn)傳統(tǒng)高效菌種篩選時(shí)以目標(biāo)污染物的降解為惟一手段, 結(jié)合微生物的遺傳特征、污染物可生物降解性和生物修復(fù)速率等多方面因素, 可開發(fā)出能夠維持異常代謝特征或?qū)瘜W(xué)污染物或環(huán)境壓力具有更好耐受性的高效菌種。通過分析環(huán)境微生物菌群的組成和結(jié)構(gòu), 微生物的生態(tài)環(huán)境、種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化, 篩選具有高效降解性能、良好生態(tài)適應(yīng)性、能在目標(biāo)污染地維持相當(dāng)持久性和活性的微生物菌株作為生物強(qiáng)化接種體, 是提高生物強(qiáng)化技術(shù)的有效手段。
利用基因工程手段構(gòu)建具有高效降解性能的土著微生物, 或直接利用具有代謝性能的可移動(dòng)基因組分進(jìn)行強(qiáng)化, 可避免與土著微生物競爭資源和空間, 是未來生物強(qiáng)化技術(shù)的發(fā)展方向。
分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)生物強(qiáng)化技術(shù)不僅在構(gòu)建高效微生物中發(fā)揮重大作用, 而且是監(jiān)控、探測、分析高效微生物在新的生態(tài)系統(tǒng)中種群結(jié)構(gòu)多樣性及變化的有力工具。以16SrRNA目標(biāo)寡核苷酸探針的熒光定量雜交(FISH)、變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)等分子生物學(xué)手段與微生物生態(tài)學(xué)相結(jié)合, 是評(píng)價(jià)生物強(qiáng)化和生物刺激的有效工具, 已經(jīng)成為研究給定環(huán)境中微生物菌群行為和生物強(qiáng)化后整個(gè)環(huán)境生態(tài)的重要學(xué)科。如何更好地探索目標(biāo)微生物的降解特征、生態(tài)模式, 更好地對(duì)系統(tǒng)和環(huán)境參數(shù)的變化做出反應(yīng), 并能夠定性定量地分析微生物與污染物降解的相關(guān)性, 確定生物強(qiáng)化技術(shù)工藝工程設(shè)計(jì)的關(guān)鍵參數(shù), 如何將生物強(qiáng)化技術(shù)與微生物刺激、各種微生物固定化技術(shù)相結(jié)合, 提高外源微生物的存活能力和降解活性, 這些都是未來生物強(qiáng)化技術(shù)研究的方向。
201411141339343281.zip
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