抗生素的濫用可提高和加速微生物的抗生素抗性。由于在過去的半個世紀(jì)中，微生物抗生素抗性的增長速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過新型抗生素的發(fā)現(xiàn)與發(fā)明速度，抗生素抗性已成為了全球性的健康風(fēng)險(xiǎn)問題并受到廣泛關(guān)注。據(jù)估計(jì)，全球每年約有70萬死亡病例可歸咎于耐藥微生物感染。如果不采取任何措施，至2050年，這一死亡人數(shù)會進(jìn)一步增長至每年1000萬例。已有研究表明，傳統(tǒng)污水處理工藝無法有效去除污水中的抗生素抗性細(xì)菌(Antibiotic resistant bacteria, ARB)和抗性基因(Antibiotic resistance genes, ARGs)。不僅如此，水處理過程中未被完全去除的抗生素以及其他化學(xué)物質(zhì)(比如其他藥物和重金屬等)會促進(jìn)抗性基因再污水處理設(shè)施中的水平轉(zhuǎn)移，使微生物可以從周圍環(huán)境中(比如污水處理設(shè)施中的不同處理單元)攝取游離的抗性基因從而獲得抗生素抗性。

為了解決上述問題，加州理工學(xué)院Hoffmann教授研究組和克拉克森大學(xué)楊陽教授研究組結(jié)合紫外光和高級氧化消毒的原理，開發(fā)了一種基于二氧化鈦藍(lán)色納米管(Blue TiO2nanotube arrays, BNTAs)材料的紫外光輔助電化學(xué)氧化(UV-assisted electrochemical oxidation, UV-EO)工藝，用于深度去除污水中ARB及ARGs。在該小試研究中，兩種ARGs-四環(huán)素和磺胺甲惡唑抗性基因(tetA和sul1)，以及被它們分別轉(zhuǎn)化的耐四環(huán)素(tetracycline)和耐磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole)大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)經(jīng)由UV-EO處理后分別由qPCR和選擇性瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行定量分析。與單一紫外光消毒相比，UV-EO有效增強(qiáng)了ARB和ARGs的去除效率。其中，由電化學(xué)氧化氯離子 (Cl-)生成的自由氯以及隨后發(fā)生的紫外光和氯的光催化反應(yīng)使得去除效率被進(jìn)一步提高。在Cl-存在的條件下，UV-EO(UV-EO/Cl-)基于光通量的一級動力學(xué)速率常數(shù)對長靶和短靶序列分別為單一紫外光輻照反應(yīng)下的 2.1-2.3和1.3-1.8倍。通過凝膠電泳和動力學(xué)模型計(jì)算，我們進(jìn)一步解析了質(zhì)粒DNA被不同自由基破壞的反應(yīng)機(jī)理。最后我們證明了UV-EO可以有效地消除廁所廢水中的ARB和ARGs，盡管反應(yīng)速率略低于模擬廢水實(shí)驗(yàn)觀測值。

圖1：紫外光光電催化去除抗性細(xì)菌與基因研究的實(shí)驗(yàn)方案

UV-EO實(shí)驗(yàn)在可接收側(cè)向UV輻照的光反應(yīng)器中進(jìn)行。我們使用了BNTA和鉑網(wǎng)分別作為陽極和陰極電極，使用波長為254 nm的紫外光(UV254)為紫外光源。使用碘化鉀作為化學(xué)露光計(jì)測得的反應(yīng)池內(nèi)的UV254輻照強(qiáng)度為5.0+0.1 mW/cm2。我們在廁所廢水中檢出較高濃度的兩種ARGs-tetA和sul1。因此它們被選為本研究中的目標(biāo)基因。如圖1所示，我們設(shè)計(jì)了特定的引物并借助PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了兩種目標(biāo)ARGs的全長序列。這些序列被分別克隆進(jìn)載體質(zhì)粒中組裝為分別含有tetA和sul1的新載體質(zhì)粒- pEB1-tetA和pEB1-sul1。編輯后的載體質(zhì)粒通過脈沖電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)移至感受態(tài)細(xì)胞E. coliMegaX DH10B T1R，進(jìn)而獲得分別具有四環(huán)素和磺胺甲惡唑抗性的大腸桿菌細(xì)胞。我們研究了細(xì)胞內(nèi)ARGs(intracellular ARGs, i-ARGs)和細(xì)胞外ARGs(extracellular ARGs, e-ARGs)在三種不同處理?xiàng)l件(UV254、UV-EO以及UV-EO/Cl-)下的去除效果。

圖2：電極的導(dǎo)帶、價(jià)帶和費(fèi)米能級示意圖(a)二氧化鈦納米管，(b)二氧化鈦藍(lán)色納米管以及(c)紫外光輻照下的二氧化鈦藍(lán)色納米管

我們選用藍(lán)色納米管(BNTAs)作為電極材料。在此前的系列工作中(10.1021/acscatal.7b04340；10.1021/acs.est.6b03540)，我們報(bào)道了藍(lán)色納米管獨(dú)特的光電特性。BNTAs 特有的Ti3+摻雜態(tài)賦予其優(yōu)秀的導(dǎo)電能力。這個物理現(xiàn)象直觀表現(xiàn)為費(fèi)米能級上移至導(dǎo)帶(圖2a 至b)。此時(shí)在合適的陽極電位下，外界電子可以通過隧穿效應(yīng)注入導(dǎo)帶，促成電化學(xué)氧化反應(yīng)(圖2b)。本研究發(fā)現(xiàn)，良好導(dǎo)電的BNTAs仍保有半導(dǎo)體材料的性質(zhì)。在紫外光輻照下，光生電子可以穩(wěn)定Ti3+摻雜態(tài)、提高材料在高陽極電位下的穩(wěn)定性。同時(shí)光生空穴(h+)可以通過光催化路徑產(chǎn)生更多的自由基和氧化劑。

圖3：不同反應(yīng)條件下苯甲酸探針分子的降解動力學(xué)及模型擬合結(jié)果

由于苯甲酸 (benzoic acid, BA)可與多種自由基反應(yīng)的特性，我們使用BA作為探針分子間接定量分析了自由基的產(chǎn)量。通過動力學(xué)模型模擬，我們進(jìn)一步估算了多種自由基(•OH、 Cl•、 Cl2•-、 ClOH•-等)的濃度。如圖3所示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(點(diǎn))能被動力學(xué)模型(虛線)較好地?cái)M合。結(jié)合實(shí)驗(yàn)觀測和模型模擬，我們發(fā)現(xiàn)在氯離子存在的條件下，Cl2•-、Cl•和•OH是EO反應(yīng)中主要的自由基物種。紫外輻照能夠通過均相光化學(xué)反應(yīng)(游離氯光解)和異相催化反應(yīng)(光生空穴氧化)提高EO 過程的自由基的產(chǎn)率。

圖4：不同條件下二氧化鈦藍(lán)色納米管對抗生素抗性大腸桿菌和抗性基因的去除動力學(xué)

我們進(jìn)一步測試了抗生素抗性大腸桿菌在三種不同反應(yīng)條件下(單一UV254、UV-EO/以及UV-EO/Cl-)的去除效果(如圖4所示)。我們發(fā)現(xiàn)去除ARGs比殺滅ARB更具有挑戰(zhàn)性。這可能因?yàn)槌薃RG片段外，ARB細(xì)胞中的全基因組DNA序列中還有更多的“生死攸關(guān)”的靶點(diǎn)。此外自由基也可以通過破壞細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)(細(xì)胞壁)達(dá)到滅活的目的。這個結(jié)果進(jìn)一步印證了前人研究中的結(jié)論，即ARGs可以在即使宿主ARB被滅活的情況下幸存，從而繼續(xù)通過基因的水平轉(zhuǎn)移傳播抗生素抗性。我們的研究結(jié)果表明，與單一UV254工藝相比, UV/EO可借助自由基氧化反應(yīng)提高ARB和ARGs的去除效率。三種不同條件下ARB和ARGs的去除效率由高到低的順序?yàn)椋篣V-EO/Cl-> UV-EO > UV 。對上述反應(yīng)條件下長靶和短靶序列的降解曲線在符合一級多力學(xué)的范圍內(nèi)分別進(jìn)行一級動力學(xué)擬合，由此可得基于光通量的一級動力學(xué)常數(shù)。結(jié)果表明與單一UV254相比，UV-EO可將ARGs長靶和短靶序列的降解速率分別提高至1.5-1.6和1.1-1.3倍。引入Cl-可將其降解速率進(jìn)一步分別提高至2.1-2.3和1.3-1.8倍。長靶序列由于含有更多的攻擊點(diǎn)位，其降解速率顯著高于短靶序列。此外，對于同一靶序列，e-ARGs的降解速率普遍高于i-ARGs，除了一組tetA-short在單一UV254輻照下的降解實(shí)驗(yàn)中e-ARGs與i-ARGs降解速率并無顯著不同之外。

圖5：不同去除條件下含抗性基因的質(zhì)粒DNA隨時(shí)間變化的凝膠電泳圖

對上文提到的經(jīng)三種不同條件下處理了不同時(shí)間的質(zhì)粒pEB1-sul1進(jìn)行凝膠電泳測試(如圖5)。結(jié)果表明，在較低劑量的UV254輻照下，質(zhì)粒主要發(fā)生堿基對的改變。只有在足夠高劑量(> 1.5 J/cm2)的單一UV254輻照下，質(zhì)粒才會發(fā)生形態(tài)變化。而UV-EO顯著加速了質(zhì)粒的形態(tài)變化。

圖6：二氧化鈦藍(lán)色納米管-紫外光光電催化對廁所廢水中原始細(xì)菌和抗性基因的去除

最后，我們測試了UV-EO 工藝的對廁所廢水中細(xì)菌和ARGs的處理效果(如圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在300 mJ/cm2的UV254輻照劑量下，廢水中的細(xì)菌的去除率達(dá)到2.7-log10。在600 mJ/cm2的UV254輻照劑量下，兩個長靶序列tetA-long和sul1-long的去除率分別達(dá)到1.1-log10和2.9-log10，而兩個短靶序列去除率接近2-log10。UV-EO對廢水中ARGs的處理效率低于模擬廢水處理結(jié)果。原因可能包括1)自由基和游離氯被廢水中其他化合物(比如氨氮和有機(jī)物)消耗；2)紫外光被廢水中其他污染物吸收；3)廢水中細(xì)菌及ARGs濃度遠(yuǎn)低于模擬廢水。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)UV-EO 可以在降解COD和氨氮之前優(yōu)先去除ARB和ARGs。

綜上所述，使用BNTA作為陽極的UV-EO工藝實(shí)現(xiàn)了對ARB和ARGs的高效去除。與單一紫外光輻照相比，UV-EO提高了ARB和ARGs的去除效率。我們認(rèn)為電化學(xué)氧化工藝可被整合入現(xiàn)有的紫外消毒單元中(如開發(fā)柔性多孔電極包裹在UV光管上)從而解決ARB和ARGs帶來的新挑戰(zhàn)。 

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