石油及其制品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和使用過(guò)程中產(chǎn)生的大量石油污染物進(jìn)入環(huán)境，對(duì)土壤造成了嚴(yán)重污染，因此對(duì)石油污染土壤的治理已迫在眉睫。石油污染土壤治理技術(shù)中，與物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)相比，微生物修復(fù)技術(shù)因其修復(fù)效果好、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低、降解過(guò)程迅速和無(wú)二次污染等特點(diǎn)，被廣泛采用。微生物修復(fù)技術(shù)的本質(zhì)是通過(guò)微生物的代謝活動(dòng)將污染物降解，修復(fù)過(guò)程所用的微生物多為土著微生物；若要提高修復(fù)效果，還需引入馴化的高效石油降解菌。

 

　　相比于正交設(shè)計(jì)，均勻設(shè)計(jì)的主要優(yōu)勢(shì)是：在因素和水平數(shù)均較多的情況下，用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)就可獲得期望的結(jié)果，節(jié)省人力和物力，便于實(shí)施。目前，國(guó)內(nèi)還少見將均勻設(shè)計(jì)法用于石油污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)的研究報(bào)道。本工作采用從東營(yíng)石油污染土壤中富集、分離出的4種高效石油降解菌，對(duì)模擬石油污染土壤進(jìn)行微生物修復(fù)。在單菌種使用效果不理想的情況下，研究了多種高效石油降解菌混合使用的效果，確定了各菌的最佳配比及菌群的最優(yōu)培養(yǎng)條件，并進(jìn)一步從理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群數(shù)量方面比較了土壤經(jīng)微生物修復(fù)前后的變化，為東營(yíng)石油污染土壤微生物修復(fù)的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用提供了技術(shù)參考和理論支持。

 

　　1、實(shí)驗(yàn)部分

 

　　1.1 材料、試劑和儀器

 

　　原油：山東省東營(yíng)市某煉油廠；土壤：山東省東營(yíng)市東營(yíng)未受污染的淺層（5~25cm）土壤。土壤經(jīng)破碎、除雜、混勻、篩分后，按原油與土壤質(zhì)量比為1∶20混合均勻，制成模擬石油污染土壤（模擬土樣），并將其密封儲(chǔ)存在滅菌牛皮紙袋內(nèi)冷藏備用。

 

　　LB培養(yǎng)基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂15g/L；菌種（包括根瘤菌（A）、節(jié)細(xì)菌（B）、嗜鹽菌（C）和芽孢桿菌（D））：實(shí)驗(yàn)室保藏；表面活性劑：主要成分為槐糖脂。

 

　　PHS-3型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；

 

　　721型可見光分光光度計(jì)：北京光學(xué)儀器廠。

 

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

 

　　1.2.1  4種單菌與土著微生物石油降解率的比較

 

　　采用LB培養(yǎng)基保藏4種單菌。將模擬土樣按每份50g分別裝入80個(gè)錐形瓶中，并將錐形瓶分成5組，每組16個(gè)。取其中4組分別以50.0mL/kg的接種量加入A，B，C，D菌懸液，置于28℃恒溫箱中。剩余1組未加菌種，作為對(duì)照樣考察土著微生物的修復(fù)作用。每間隔一段時(shí)間取樣，采用重量法測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率。

 

　　1.2.2 優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)建和最佳配比的確定

 

　　對(duì)4種菌進(jìn)行2種、3種、4種的組合，分別將不同組合的混合菌按一定的接種量加入到模擬土樣中，每組加入的混合菌菌懸液的總接種量均為50.0mL/kg，各加入菌的接種量分別相等。在28℃的恒溫箱中放置40d后，測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率，從而構(gòu)建出優(yōu)勢(shì)菌群。采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的配比進(jìn)行優(yōu)化。

 

　　1.2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選取

 

　　5個(gè)影響石油降解率的代表性因素：混合菌接種量、土壤含水率、雞糞加入量、麥糠加入量和表面活性劑加入量，并將其控制在不同水平，采取均勻設(shè)計(jì)考察各因素對(duì)修復(fù)效果的影響。按確定的最佳配比將4種菌接種到石油污染土壤中，在28℃的恒溫箱中放置40d后，測(cè)定土壤試樣中石油的含量，計(jì)算石油降解率。

 

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